近日，我院吴昊星研究员团队和新加坡科技与设计大学刘晓刚教授团队合作在Angewandte Chemie（IF：16.6）发表题为“Tetrazine-Isonitrile Bioorthogonal Fluorogenic Reactions Enable Multiplex Labeling and Wash-Free Bioimaging of Live Cells”的研究论文，构建了一系列基于四嗪-异腈生物正交化学的高开启荧光探针，并探索了其荧光调控机制，验证了其作为生物正交标记工具在活细胞多靶点成像上的应用。
荧光探针可在亚细胞水平标记生物大分子，揭示其在分子网络中的作用和相关疾病演进过程的分子机制；同时也可作为信号手段实现对特异靶标如肿瘤转移病灶、神经结构的光学示踪和手术导航。这些生物医学应用都离不开高灵敏度、高信噪比的荧光探针。四嗪生物正交开启型探针已成为活细胞和活体成像的重要工具。这类探针的荧光信号仅由生物正交反应产生，可将背景信号最小化，提高成像信噪比。但目前绝大部分的四嗪探针仅对逆电子需求的Diels−Alder (IEDDA)反应表现出优异的荧光开启能力；而对于四嗪与异腈之间的[4+1]生物正交环加成反应，其荧光调控能力大幅降低。因此，针对四嗪[4+1]生物正交反应开发新的探针设计策略可为活细胞成像提供新的化学生物学工具。更重要的是，利用四嗪[4+1]反应与其他生物正交反应的相互正交性还可实现对单个细胞内多个亚细胞靶标的同时成像。
研究者在前期开发的Huaxi-Fluors荧光骨架基础上（Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60, 2393-2397.），成功构建了一系列针对四嗪[4+1]生物正交反应的荧光探针。该系列探针与苯乙基异腈或者叔丁基异腈反应后，在水溶液和乙醇中均表现出了高量子产率、高开启倍数（up to 3184-fold）、可调节的发射波长（473‒659 nm）等一系列的优异性质。研究进一步通过“暗态-亮态”理论解释了探针荧光开启机制：反应前四嗪探针处于“暗态”，基本没有荧光；与不同的异腈反应后得到的吡唑产物融入到所设计的分子共轭骨架中，使整个分子处于“亮态”从而开启荧光。与之前的四嗪荧光探针设计策略相比，该研究通过合理利用生物正交产物与分子共轭结构的关系，实现荧光探针原位生成，从而对荧光进行了高效调控，解决了以往策略中吡唑产物对荧光信号仍然抑制，成像信噪比低的难题。
图A： 经典四嗪探针IEDDA或[4+1]反应开启比较 图B：Huaxi-Fluors荧光染料原位形成策略及光学性质；图C：四嗪探针与异腈发生[4+1]反应后的机理解释；图D：细胞核的高分辨和高信噪比荧光成像（绿色）图E：细胞核（绿色）和线粒体（红色）的同时成像。
研究者随后成功地利用该探针实现了多种亚细胞结构：细胞核、溶酶体和内质网的活细胞免洗成像。在此基础上，通过对四嗪分子结构的调控，使特定的探针分子可特异性地发生四嗪[4+1]环加成反应，而不发生IEDDA反应。从而实现了所开发荧光探针与四嗪IEDDA反应、环张力促进的生物正交反应（SPAAC）、铜催化的点击反应之间的相互正交。研究者利用这些相互正交的生物正交工具，在溶液、大分子和活细胞多个层面证明标记的可行性和正交性，并在同一活细胞中对不同的亚细胞结构实现了细胞器特异性的多重标记和免洗成像。该研究工作开发的这一系列探针非常适合用于活细胞内多个靶点的动态可视化，有待在多重标记和检测工作中作出重要贡献。
我院研究生邓颖乔、于欣煜，新加坡科技与设计大学博士后沈天若为该论文的共同第一作者；吴昊星研究员以及刘晓刚教授、孙洪宝副研究员为该论文的共同通讯作者；我院为第一作者单位。研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、四川省自然科学基金、新加坡科学技术研究理事会先进制造工程基金、我院1·3·5青年人才支持计划等项目的支持。
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